КУРСОВА РОБОТА. natka@alice.ukma.kiev.ua Формування, ріст і розвиток мітохондрій в гаметогенезі та ранньому ембріогенезі хребетних. ПЛАН Синтез мітохондріальних білків і особливості формування мітохондрій. система синтезу білка в мітохондріях; продукти мітохондріального білкового синтезу; синтез мітохондріальних білків у цитоплазмі; транспорт у мітохондрії білків, синтезованих у цитоплазмі; формування окремих компонентів мембран мітохондрій. Формування мітохондрій під час процесів розвитку. 1) оогенез; 2) сперматогенез; 3) ріст та диференціювання окремих тканин і органів. 1.Вступ Роль мітохондрії у розвитку хребетних переоцінити важко. Адже всі процеси в клітині, так чи інакше пов(язані з енергетичним обміном, залежать від клітинного дихання, важливою складовою якого є окислювальне фосфорилювання. Останнє не можна уявити без мітохондріальних мембран. У процесі онтогенезу роль окислювального фосфорилювання, а отже і мітохондрій, проявляється особливо яскраво і відкриває цілий ряд питань, що потребують дослідження. По-перше, на даний час ведеться жвава наукова дискусія щодо впливу енергетичного обміну на вік клітини. Відомо, що при розвитку і старінні організму сильно змінюється поглинання кисню клітиною, і це не може не відображатися на структурі та кількості мітохондрій. Тобто, вивчаючи процеси формування мітохондрій у розвитку, ми зможемо впливати на процеси клітинного старіння та омолоджування. По-друге, широкі перспективи відкриває дослідження мітохондрії як носія власного геному. Геном мітохондрії має значно менші розміри, ніж ядерний геном, і тому є зручним об(єктом для вивчення. Крім цього, відкритим залишається питання про взаємодію мітохондріального та ядерного геномів, про перенесення генів з мітохондрії в ядро у процесі еволюційного розвитку. Дослідження цих проблем може допомогти у вирішенні багатьох питань еволюції і генетики. По-третє, досі незрозумілим є процес відтворення мітохондрій в оогенезі, і це питання також активно досліджується. У роботі використано праці як дослідників-цитологів (Зотін, Зотіна, Седжер, Білл та Ноулз, Гаузе, Мінченко), так і ембріологів (Айзенштадт, Данілова, Озернюк, Кауфман, Абрамова, Чейз та ін.). На окрему увагу заслуговують праці Озернюка, який є одним із найактивніших дослідників ролі мітохондрій у розвитку, і книга Мінченка та Дударєвої “Мітохондріальний геном”, де розкривається структура, функціонування та роль генетичного апарату мітохондрій. Робота має два розділи. У першому дається характеристика біогенезу мітохондрії - походження мітохондріальних білків, їх транспорт, структура та функції мітохондріального генетичного апарату. У другому розділі мова йде про зміну характеристик мітохондрій в оогенезі, сперматогенезі та ранньому розвитку хребетних тварин. 2. Синтез мітохондріальних білків і особливості формування мітохондрій. Формування мітохондрій є багатоступінчатим і багатокомпонентним процесом Особливістю їх утворення є те, що мітохондріальні білки є продуктами діяльності двох генетичних систем: мітохондріальної та ядерної. Просторове розділення цих двох генетичних систем є одною із причин складності їх системи взаєморегуляції як на рівні синтезу окремих білків, так і на рівні інтактної мітохондрії. Розглянемо процеси, що в сукупності утворюють єдиний механізм формування мітохондрій 1)Система синтезу білків в мітохондріях. Апарат білкового синтезу, локалізований у мітохондріях, призначення для утворення дуже малої кількості білків, що становить не більше 7 -10% білків внутрішньої мембрани мітохондрій. Основним продуктом мітохондріального білкового синтезу є поліпептиди з сильно вираженими гідрофобними властивостями (Пинус, Рабинович, 1977( Апарат трансляції мітохондрій характеризується рядом унікальних властивостей. Перш за все, це стосується розміру рибосом. Мітохондріальні рибосоми тварин - найменші серед усіх відомих типів рибосом, що зумовлено відносно невеликими розмірами рРНК, відсутністю 5S рРНК, малим розміром рибосомальних білків (Минченко, 1987(. У порівнянні з цитоплазматичними та бактеріальними мітохондріальні рибосоми тварин характеризуються більш низьким співвідношенням РНК та білка. В клітинах жаби у великій субчастинці мітохондріальних рибосом вміст РНК становить 32%, в малій субчастинці - 20%, тоді як в цитоплазматичних рибосомах ця величина дорівнює 58% РНК для великої субчастинки і 50% РНК для малої субчастинки. Для мітохондрій ссавців встановлено, що вміст РНК у їхніх рибосомах приблизно вдвічі нижчий в порівнянні з іншими рибосомами (Озернюк, 1978(. Рибосоми тварин містять не менш ніж 87 білків: 52 білки у великій субодиниці (молекулярна маса - 8,8 - 49 тис. дальтон) і 33 білки у меншій субодиниці (молекулярна маса - 10 - 48 тис. дальтон), причому всі вони різняться за електрофоретичною рухливістю від білків цитоплазматичних рибосом. Унікальними є і мітохондріальні мРНК. Вони не містять довгих фланкіруючих ділянок, що не транслюються, які присутні в мРНК з цитоплазми, і відповідальні за зв’язування з рибосомами, характеризуються вкороченими полі-А-послідовностями та відсутністю “кепів”, необхідних для ефективної трансляції цитоплазматичних мРНК (Гаузе, 1977(. Що стосується мітохондріальної ДНК, то відомо, що вона успадковується лише по материнській лінії. Сцолозі (Szollozi, 1965; цит. за: Билл, Ноулз, 1981( виявив, що у щурів при заплідненні мітохондрії сперміїв входять в яйцеклітину, а потім набухають і руйнуються. Існують докази того, що після запліднення мітохондріальна ДНК елімінується (Hutchison et al. 1974, цит. за Билл, Ноулз, 1981(. Висловлено припущення, що по батьківській лінії може передаватися не більш ніж одна молекула ДНК мітохондрій на 25 тисяч материнських молекул.(Минченко, Дударева, 1990( У ссавців мітохондріальний геном представлений кільцевою мітохондріальною ДНК розміром близько 5 мкм (молекулярна маса приблизно 10 МД), що присутня в мітохондріях у вигляді ковалентно замкнутих форм, що перебувають у надспіралізованому стані (Минченко, 1987(. Комплементарні ланцюги в мітохондріальної ДНК більшості тварин суттєво різняться за плавучою щільністю в градієнтах лужного хлориду цезію, оскільки мають неоднаковий середній нуклеотидний склад, що коливається у тварин різних видів у значних межах. Частина молекул ДНК в мітохондріях клітин більшості організмів присутня у вигляді олігомерних форм, що поділяються на два класи: кільцеві олігомери, тобто молекули з контурною довжиною, кратною довжині мономерних кілець і ланцюгові олігомери (катенани) що складаються із зв’язаних топологічним зв’язком мономерних кілець (Минченко, Дударева, 1990(. Особливістю мітохондріальної системи трансляції є також те, що синтез білків в мітохондріях людини і тварин здійснюється за участю лише 22 - 23 тРНК. Цієї кількості тРНК достатньо завдяки тому, що система генетичного коду мітохондрій змінена в порівнянні із універсальним генетичним кодом. (табл.1). Більшість мітохондріальних тРНК здатні зчитувати по чотири кодони, які різняться за третім нуклеотидом, тобто при наявності чотирьох варіантів кодування однієї амінокислоти. Слід також відмітити, що розмір мітохондріальних тРНК клітин тварин менший у порівнянні з цитоплазматичними тРНК. (Anderson et al., 1981(. Табл.1 Генетичний код мітохондрій (Anderson et al., 1981(. Phe UUU 77 Ser UCU 32 Tyr UAU 46 Cys UGU 5
UUC 141
UCC 99
UAC 89
UGC 17
Leu UUA 73
UCA 83 Ter UAA - Trp UGA 93
UUG 16
UCG 7
AAG -
UGG 11
Leu CUU 65 Pro CCU 41 His CAU 18 Arg CGU 7
CUC 167
CCC 119
CAC 79
CGC 25
CUA 276
CCA 52 Gln CAA 81
CGA 29
CUG 45
CCG 7
CAG 9
CGG 2
Ile AUU 125 Thr ACU 51 Asn AAU 33 Ser AGU 14
AUC 196
ACC 155
AAC 131
AGC 39
Met AUA 167
ACA 133 Lys AAA 85 Ter AGA -
AUG 40
ACG 10
AAG 10
AGG -
Val GUU 30 Ala GCU 43 Asp GAU 15 Gry CGU 24
GUC 49
GCC 124
GAC 51
CGC 88
GUA 70
GCA 80 Glu GAA 64
GGA 67
GUG 18
GCG 8
GAG 24
GGG 34
У таблиці показано бокси, що зчитуються за допомогою єдиної тРНК. Вказано також загальну кількість амінокислотних кодонів, знайдених у генах та послідовностях, які можуть бути генами ДНК мітохондрій. Ще однією особливістю синтезу мітохондріальних білків є те, що він стійкий до дії специфічного інгібітора цитоплазматичної трансляції циклогексиміду і специфічно пригнічується хлорамфеніколом і бромідом етидію. Синтез білків в ізольованих мітохондріях протікає з низькою швидкістю і нелінійно. Це, можливо, зумовлено затримкою просування полірибосоми по мРНК в її середній ділянці і частково присутністю в мітохондріях інгібітора трансляції, який знижує загальну кількість полірибосом шляхом порушення цілісності мРНК (Шугалий и др., 1974(. 2)Продукти мітохондріального білкового синтезу Мітохондріальний геном тварин кодує синтез відносно невеликої кількості поліпептидів. В мітохондріальній ДНК клітин людини та тварин ідентифіковано 13 рамок зчитування для п(яти відомих і восьми ще не вивчених білків. В генах, що кодують синтез мітохондріальних білків у клітинах тварин інтрони не виявлені, на відміну від клітин вищих рослин та грибів (Anderson et al, 1981(. Цікавим є той факт, що кількість білків - продуктів мітохондріальної трансляції, виявлених за допомогою електрофорезу, значно перевищує кількість рамок зчитування, а отже і кількість потенціальних генів, ідентифікованих в Н-тяжі мітохондріальної ДНК. Це може пояснюватися тим, що серед білків, які синтезуються в мітохондрії, є такі, що кодуються L - тяжем мітохондріальної ДНК, хоча на ньому рамки зчитування ще не виявлені. Крім цього, можна припустити, що деякі з ідентифікованих рамок зчитування можуть кодувати синтез більш ніж одного білка. На даний час серед мітохондріальних продуктів трансляції ідентифіковані три субодиниці ( І, ІІ і ІІІ ) цитохромоксидази, апоцитохром b і дві субодиниці АТФ-ази, причому гени, що кодують синтез обох субодиниць (6-ї та 8-ї) виявлені лише в геномі мітохондрій дріжджів, а в клітинах тварин однозначно виявлений лише ген 6-ї субодиниці. Детально вивчено функціональне значення цілого ряду білків, які синтезуються в мітохондріях. Існують дані, що деякі із синтезованих в мітохондріях поліпептидів можуть виходити з мітохондрій і грати певну роль в ядерно-мітохондріальних взаємовідношеннях, зокрема в регуляції експресії ядерних генів, що кодують синтез мітохондріальних білків (Bibb et al., 1981; цит. за: Минченко, 1987(. Доказом цитоплазматичного походження основної маси мітохондріальних білків є такі ознаки: мітохондрії цитоплазматичних мутантів petite дріжджів мають дефективний дихальний ланцюг (відсутні цитохроми аа3, В і С), в них редукована або повністю відсутня мітохондріальна ДНК, а також відсутня, очевидно, система синтезу білка. Отже, всі білки, присутні у таких дефектних мітохондріях, мають цитоплазматичне походження; мітохондрії клітин, що ростуть у присутності інгібіторів мітохондріального білкового синтезу (хлорамфеніколу або еритроміцину), мають дефектну дихальну систему. При повному інгібуванні білкового синтезу в мітохондріях всі білки, що залишилися в органелі, мають цитоплазматичне походження. Природно, що мітохондрії клітин, які ростуть в присутності інгібіторів синтезу мітохондріальних білків, за своєю будовою та набором ферментів схожі на мітохондрії цитоплазматичних мутантів petite дріжджів (Озернюк, 1985(. Отже, значення мітохондріального білкового синтезу полягає в забезпеченні мітохондрій невеликою кількістю гідрофобних білків, які входять у склад ряду ферментних комплексів, локалізованих на внутрішній мембрані мітохондрій, а також у синтезі поліпептидів, які беруть участь в регуляції ядерно-цитоплазматичних взаємовідношеннях. 3)Синтез мітохондріальних білків у цитоплазмі. Мітохондрії містять у зовнішніх та внутрішніх мембранах, міжмембранному просторі і матриксі кілька сотень білків, синтез яких протікає на матрицях, що кодуються ядерним геномом. Для багатьох мітохондріальних ферментів відомі функціонуючі в цитоплазмі аналоги, але цитоплазматичні та мітохондріальні форми цих білків кодуються різними генами. Синтез цих білків відбувається як на вільних, так і на зв(язаних із мембранами ендоплазматичного ретикулуму цитоплазматичних полісомах. (Сэджер, 1975(. На даний час детально вивчено синтез великої кількості мітохондріальних білків зовнішніх та внутрішніх мембран, міжмембранного простору та матриксу і їх транспорт в мітохондрії. Всі вивчені білки зовнішніх мембран мітохондрій синтезуються в цитоплазмі і в такому вигляді вбудовуються у мембрану, а всі інші білки (принаймні, частина з них) синтезуються у вигляді попередників з N-кінцевою лідерною послідовністю розміром від 1 до 6 тис. дальтон. Білки чи їх попередники, що поступають з цитоплазми, розпізнаються певними структурами (рецепторами), локалізованими на зовнішній мембрані мітохондрій. У білків-попередників в N-кінцевій лідерній послідовності міститься не лише інформація, необхідна для розпізнавання рецептором, а й інформація, що забезпечує подальший транспорт білка і окремі стадії його процесингу (Adoutte, 1983, Benson et al., 1984; цит. за:Минченко, 1987(. 4)Транспорт у мітохондрії білків, синтезованих у цитоплазмі. Очевидно, існує не менш ніж три механізми транспорту білків та їх попередників у мітохондрії. Перший механізм характерний для білків зовнішніх мембран мітохондрій, які синтезуються на цитоплазматичних полісомах у вигляді зрілих форм. Ці білки мають сигнальні послідовності, за допомогою яких впізнаються певними структурами зовнішньої мембрани і вбудовуються в неї. Другий та третій механізми транспорту характерні для тих мітохондріальних білків, які синтезуються в цитоплазмі у вигляді попередників. Ці білки своїми розпізнавальними структурами взаємодіють з певними рецепторами на зовнішній мембрані і проникають крізь неї. Білки, що транспортуються за другим механізмом, проходять через внутрішню мембрану за рахунок процесу, який вимагає наявності електрохімічного градієнта на внутрішній мембрані; потім відбувається відщеплення лідерної послідовності. Транспорт таких білків не спряжений облігатно з процесингом, оскільки попередники білків ефективно накопичуються всередині мітохондрій (матриксі чи внутрішніх мембранах) навіть при сильному інгібуванні мітохондріальних протеїназ. За третім механізмом надходять білки з цитоплазми в міжмембранний простір. Ці білки транслокуються крізь зовнішню мембрану мітохондрій, а потім N-кінцева частина попередника білка проходить через внутрішню мембрану в матрикс, де за допомогою матриксних протеїназ відбувається відщеплення частини лідерної послідовності. Після цього утворена форма попередника повертається у міжмембранний простір, де зв(язується із зовнішньою поверхнею внутрішньої мембрани, і лише після цього відбувається завершальний процесинг під дією зв(язаної з внутрішньою мембраною протеїнази. Транспортовані в мітохондрії поліпептиди зазнають посттрансляційної модифікації. В мітохондріях виявлені протеїнкінази, які фосфорилюють білки зовнішньої та внутрішньої мембран мітохондрій (Минченко, Дударева, 1990(. 5)Формування окремих компонентів мембран мітохондрій. Розмноження мітохондрій. Збирання компонентів мітохондрій, що синтезуються у різних частинах клітини, є досить складним процесом, що регулюється як на рівні взаємної координації мітохондріального та цитоплазматичного білкового синтезу, так і на рівні властивостей самих компонентів. Вважають, що гідрофобні продукти синтезу білка в мітохондріях зв(язуються з ліпідами. Утворені протеоліпіди здатні до взаємної агрегації і формування більш крупних комплексів, які можуть бути “матрицями” для зв(язування білків, які синтезуються у цитоплазмі. Такий висновок для хребетних вперше був зроблений у роботах Дроза та Бержерона (Droz, Bergeron, 1965; цит. за: Озернюк, 1978(. При вивченні особливостей ультраструктури та властивостей внутрішньої мембрани мітохондрій було зроблено висновок, що в мітохондріях існують зони росту, в яких переважно і відбувається вбудовування нових компонентів. Зони росту, на думку Вернера та Нейперта, розташовані в ділянках, де внутрішня мембрана переходить у кристи. (Werner, Neupert, 1972; цит. за: Озернюк, 1978(. Наскільки складним є питання про механізм розмноження мітохондрій, свідчить той факт, що досі не зрозуміло, як відбувається процес збільшення кількості мітохондрій. На думку Озернюка (1978(, мітохондрії розмножуються шляхом поділу. Проте в роботах останніх років автори притримуються думки, що мітохондрії виникають в результаті формування мітохондріальних мембран на структурах-попередниках(Лузиков, 1980; цит. за: Зотин, Зотина, 1993(. Оскільки у багатьох випадках мітохондрії здатні утворювати неперервний мітохондріальний ретикулум, або ж виникають гігантські мітохондрії (Айзенштадт, 1984(, то не виключено, що остання точка зору більше відповідає реальності. Все це показує, що висловлювати які-небудь припущення щодо механізму збільшення мітохондрій у період малого росту ооцитів поки що рано. Формування мітохондрій під час процесів розвитку. 1) оогенез В ооцитах багатьох тварин накопичується величезна кількість мітохондрій. У зрілих ооцитах жаби в 100000 разів більше мітохондрій, ніж у соматичній клітині цього виду (щоправда, тут слід враховувати і співвідношення розмірів соматичної клітини та яйцеклітини). Веббом та Смітом (Webb, Smith, 1977; цит. за: Айзенштадт, 1984( було підраховано, що в ооциті в 300 разів більше мітохондріальної ДНК ніж ядерної, що свідчить про активний ріст кількості мітохондрій в період оогенезу. У багатьох тварин розмноження мітохондрій відбувається в основному до початку вітелогенезу. Наприклад, у жаби в період вітелогенезу і на ранніх стадіях ембріогенезу мітохондрії практично не діляться, тобто інтенсивне розмноження іде в превітелогенних ооцитах (Айзенштадт, 1984(. Таким чином, активна реплікація мітохондріальної ДНК в превітелогенних ооцитах йде незалежно від ядерної ДНК. Під час оогенезу більшості вищих тварин відбувається суттєва зміна ультраструктури мітохондрій. На найбільш ранніх етапах оогенезу ооцити містять дрібні одиничні рівномірно розсіяні в цитоплазмі мітохондрії з невеликою кількістю слаборозвинених крист. Наприкінці цієї стадії, при переході до малого росту, в навколоядерній зоні виникають острівці електронно-густої речовини (міжмітохондріального цементу), навколо якого концентруються мітохондрії. Це утворення локалізоване переважно з одного боку від ядра і носить назву “жовткового ядра” або “тіла Бальбіані”. У нього входять також мембрани комплексу Гольджі, цистерни гладенького ендоплазматичного ретикулуму, мультивезикулярні тільця та ліпідні гранули, проте основним компонентом є все ж мітохондрії. Функція “тіла Бальбіані” багато в чому залишається невідомою. Раніше його пов(язували із утворенням жовтку. Зараз вважають, що “тіло Бальбіані” є центром формування мітохондрій та інших клітинних органел (Озернюк, 1978(. До початку вітелогенезу структура мітохондрій (форма, кількість крист) близька до тієї, що мають ооцити, які вже закінчили ріст. Проте об’єм мітохондрій в процесі вітелогенезу продовжує зростати. Так, від початку малого росту до початку відкладення жовтка об’єм мітохондрій збільшується майже в 4 рази, а під час вітелогенезу ця величина зростає в 3,3 рази (Пальмбах, Озернюк, 1975(. Уявлення про кількісну характеристику росту мітохондріальних мембран під час оогенезу дає морфометричний аналіз мітохондрій, проведений на ооцитах в’юна (табл. 2). Табл. 2. Розміри мітохондрій в ооцитах в’юна, що ростуть (Пальмбах, Озернюк, 1975( Стадія оогенезу діаметр Обєм міто- Протяжність, ум. од.
Ооцитів, мм хондрій, мкм3 зовнішньої мембрани крист в мітохондрії
Початок вітелогенезу 400 0,18(0,006 35,4(1,3 83,4(6,4
Кінець великого росту 800 0,65(0,11 - -
На протязі малого росту ооцитів (у в’юна він триває приблизно 1 рік) об’єм мітохондрій зростає більш ніж вдвічі. Протяжність зовнішньої мембрани мітохондрій за цей період збільшується на 33%, а протяжність крист зростає в 5 разів, тобто темп росту крист значно перевищує темп росту зовнішньої мембрани мітохондрій. Аналіз ультраструктурних особливостей ооцитів різних стадій показав, що по мірі росту розмірів мітохондрій і протяжності мембран гранулярного ендоплазматичного ретикулуму між ними встановлюються певні структурні взаємовідношення. При переході до великого росту ооцитів їх мітохондрії тісно зближуються з мембранами ендоплазматичного ретикулуму. Між мітохондріями та мембраною завжди залишається щілина від 30 до 70 нм завширшки. Слід відмітити, що на ділянках мембрани ендоплазматичного ретикулуму, зближених з мітохондріями, кількість рибосом в 2 - 3 рази більша, ніж на інших ділянках ретикулуму. (Озернюк, 1985(. Паралельно із зростанням розмірів мітохондрій в процесі оогенезу спостерігається збільшення вмісту мітохондріального білка в ооцитах, а також активності маркерного ферменту мітохондрій - цитохромоксидази. Одна із особливостей росту мітохондрій в ооцитах полягає в тому, що розміри цих органел і їх збільшення в різних зонах ооцита різні. На ранніх стадіях оогенезу відмінності малопомітні. При переході до великого росту в навколоядерній зоні площа, яку займають ці органели, приблизно вдвічі більша, ніж на периферії ооцита. Мітохондрії цих двох зон цитоплазми ооцита відрізняються також за ультраструктурою: навколо ядра локалізовані дрібні органели з невеликою кількістю слабко виражених крист, тоді як на периферії клітини розташовані великі мітохондрії з добре розвиненими кристами (Айзенштадт, 1984(.. Формування мітохондрій і їх ріст є складним багатостадійним процесом, оскільки окремі компоненти цих органел синтезуються в різних частинах клітини. Для характеристики росту мітохондрій під час оогенезу були вивчені особливості синтезу білків цих органел в ооцитах різних стадій. За результатами досліджень синтез мітохондріальних білків під час оогенезу зростає в багато разів (табл. 3) Табл.3 Включення 14С-валіну в білки мітохондрій ооцитів в’юна різних стадій оогенезу в дослідах in vivo (Озернюк, 1976) Стадія оогенезу Включення 14С-валіну
імп/хв/100 шт імп/хв/мг білка
Малий ріст 9342(2720 21173(632
Великий ріст превітелогенез
254440(52210
6359(1380
кінець великого росту 744560(155815 908(190
Найбільш суттєве посилення швидкості включення міченого попередника в білки мітохондрій спостерігається на ранніх стадіях оогенезу. Від стадії малого до початку великого росту ооцитів швидкість синтезу мітохондріальних білків зростає в 27 разів. Посилення синтезу білків мітохондрій призводить до збільшення маси цих органел в ході оогенезу. Щільність мітохондрій є важливою структурною характеристикою, що, як правило, відображає величину співвідношення білки/фосфоліпіди у мембрані. Озернюк та Котомін (1976( використовували ооцити в’юна ранніх стадій оогенезу, до початку процесу жовткоутворення для визначення щільності мітохондрій. Щільність визначали за розташуванням піка цитохромоксидазної активності після центрифугування мітохондрій у лінійному градієнті густини сахарози (табл.4) Табл. 4. Щільність мітохондрій ооцитів в’юна (в г/см3) (Озернюк, Котомін, 1976) Номер досліду Стадія оогенезу
малий ріст початок великого росту
1 1,149 1,162
2 1,147 1,162
3 1,148 1,165
4 - 1,161
5 - 1,166
середнє 1,148(0,0006 1,163(0,0009
При переході від стадії малого росту до початку великого росту ооцитів співвідношення білки/фосфоліпіди зростає більш ніж на 20%. Таким чином, зростання щільності мітохондрій під час оогенезу пов’язане із збільшенням співвідношення білки/фосфоліпіди, тобто із зростанням відносного їх вмісту у мембранах мітохондрій по мірі росту цих органел. Отже, як бачимо, кількість, розмір, ультраструктура і розташування мітохондрій в оогенезі помітно змінюється, впливаючи тим самим на швидкість поглинання ооцитом кисню, а отже і на ріст ооцита в цілому, що в свою чергу відбивається на процесах запліднення та ембріогенезу. 2)Сперматогенез На даний час роль мітохондрій у структурі сперматозоїда пов’язують із процесом постачання енергії, необхідної для руху джгутиків (щоправда, в сперматозоїдах деяких тварин мітохондрії відсутні, як наприклад, у деяких видів червів). В сперматогенезі більшості тварин мітохондрії зазнають змін ультраструктури та розташування. У найпростішому випадку в кінці сперматогенезу спостерігається злиття мітохондрій, до цього розкиданих по цитоплазмі. При злитті мітохондрії утворюють від 1 до 10 крупних хондріосфер, які розташовуються коло центріолі (Бурнашева и др., 1982(. У деяких видів кісткових риб (Salmo salar, Lebistes reticulatus) мітохондрії формують низький комірець при основі голівки, у інших вонни витягуються і комірець стає високим (Кауфман, 1990(. У карпових риб мітохондрії, як правило, мають вигнуту підковоподібну чи видовжену форму. В середній частині сперміїв гірчака локалізоване лише одне гігантське мітохондріальне тільце, яке займає більшу частину цитоплазми і розташоване навколо каналу незімкнутим кільцем. Мітохондріальний матрикс - середньої електронної щільності, кристи численні (Емельянова, Макееваа, 1985(. У хвостатих амфібій сперматозоїди мають складну будову. Мітохондрії у них розташовуються в проксимальній частині джгутика у вигляді комірця навколо випуклої поверхні опорного філамента. У ропухи звичайної Bufo bufo невеликий комірець із мітохондрій лежить при основі голівки. У жаби Rana temporaria верхня частина джгутика оточена витягнутими мітохондріями, що утворюють навколо неї щільний циліндр (Данилова, 1973(. У плазунів, птахів та ссавців сперматозоїди мають оболонку з мітохондрій, спірально закручену навколо проміжного відділу. Плазуни, крім цього, мають особливу фіброзну оболонку, яка оточує (принаймні, у деяких змій) осьовий комплекс фібрил і відділяє його від мітохондріальної оболонки. В оболонці мітохондрії зберігають свою індивідуальність, розташовуючись навколо джгутика вздовж довгої осі проміжного відділу. Шийка і проміжний відділ сперматозоїда мають незвичайну будову: у склад проміжного відділу входить ше так званий циліндр шийки - структура, що не має аналогів в сперматозоїдах інших типів тварин. Він представляє собою муфту із щільної речовини, що оточує центріолі та базальну частину джгутика. Циліндр розташований між основою ядра і мітохондріальною оболонкою проміжного відділу і в зрілому сперматозоїді являє собою з’єднувальний сегмент каудальний край циліндра шийки починається коло межі мітохондріальної оболонки. Мітохондрії в оболонці плазунів розташовуються хаотично і мають звивисті конури, утворюючи рихлу спіраль навколо джгутика. В мітохондріальній оболонці змій спостерігаються ще додаткові ультраструктури, відсутні у сперматозоїдах інших тварин, - так звані темні пластинки, що вставлені між мітохондріями з нерегулярними інтервалами по довжині джгутика. Мітохондріальна оболонка в сперматозоїдах плазунів розвивається досить пізно, коли вже відбувається конденсація хроматину в ядрі. Всі мітохондрії скупчуються коло шийки і розташовуються радіально, а потім спускаються вздовж проміжного відділу навколо фіброзної оболонки. У ссавців проміжний відділ також характеризується наявністю мітохондрій, що спірально оточують пучок осьових фібрил. Мітохондрії в оболонці можуть мати сферичну або циліндричну форму. В оболонці вони зберігають індивідуальність, примикаючи дна до одної кінцем до кінця. У летучих мишей мітохондрії розташовуються без особливої впорядкованості вздовж ходу спіралі. У бурої нічниці всі мітохондрії однакові за розмірамиі мають форму півмісяця на поперечних зрізах проміжного відділу. Місце з’єднання двох мітохондрій строго відповідає лінії, яка проходить через пару центральних фібрил осьового комплексу. Місця з’єднання пар мітохондрій в кожному повороті спіралі знаходиться на одній лінії, що проходить вздовж джгутика. Такого строгого порядку у розташуванні мітохондрій не спостерігали у жодного іншого виду. Загальна кількість мітохондрій в проміжному відділі сперматозоїда бурої нічниці становить 114 - 120 (Данилова, 1978(. Мітохондрії сперматозоїдів бика, виділені за допомогою фракціонування шляхом диференційованого центрифугування, мають біохімічні властивості, що дуже нагадують властивості мітохондрій з інших тканин. Вони каталізують процеси аеробного окислення різних субстратів, включаючи проміжні субстрати циклу Кребса. (Бурнашева и др., 1982(. 3) Ріст та диференціювання окремих тканин і органів Під час зародкового розвитку і диференціювання тканин та органів також відбувається інтенсивний ріст мітохондріальних мембран Одна із перших робіт у цьому напрямку була проведена в 1955р. Боллом та Вебером (Boell, Weber, 1955; цит. за: Озернюк, 1978(. Ці автори, вивчаючи активність цитохромоксидази зародків амфібій, дійшли до висновку, що під час зародкового розвитку відбувається ріст та диференціювання мітохондрій. Пізніше цей висновок був підтверджений електронно-мікроскопічним дослідженням структури мітохондрій на різних стадіях розвитку. Збільшення розмірів мітохондрій і протяжності крист було відмічено на ранніх стадіях зародкового розвитку (бластула, гаструла), а також на більш пізніх етапах розвитку та під час розвитку і диференціювання окремих тканин та органів. Так, збільшення розмірів мітохондрій і протяжності крист було відмічено підчас розвитку серцевого м’яза жаби, щура, печінки курчати і щура. Уявлення про темп росту мітохондрій в цей пріод дає дослідження Стеффенса та Білса (Stephens, Bils, 1967; цит. за: Озернюк, 1978(, в якому було показано, що протягом семи днів розвитку курчати розмір мітохонрій збільшується у п’ять разів. Під час росту тканин і органів відбувається кількісна зміна співвідношення різних типів мітохондрій, що ростуть, зокрема зміна співвідношення набухлих і компактних (стиснутих) мітохондрій, які, як відомо, відображають певний функціональний стан мітохондрій. Так, при вивченні популяції мітохондрій зародків ранніх стадій шпорцевої жаби було показано, що набухлий і компактний тип мітохондрій представлений у рівних кількостях, тоді як у печінці, що розвивається, переважає компактний тип мітохондрій (Kistler, Weber, 1974; цит. за: Озернюк, 1978(. Доповненням до морфологічної картини росту мітохондрій в процесі зародкового розвитку є вимірювання кількості мітохондріального білка в зародках і окремих органах, а також визначення активності мітохондріальних ферментів. У яйцях в’юна не виявлено суттєвої зміни вмісту мітохондріальних білків за час розвитку від запліднення до вилуплення з оболонок , що співпадає із спостереженнями про сталість вмісту цитохромів a, b та c і активності цитохромоксидази (Абрамова, Васильева, 1973(. В яйцях шпорцевої жаби кількість мітохондріальних білків не змінюється на різних стадіях ембріогенезу (Chase, Dawid, 1972( і починає швидко зростати лише після вилуплення зародків з оболонок. З роботи Абрамової та Васильєвої (1973( видно, що вміст загального білка в зародках від стадії 9 год. (пізня бластула) до стадії 30 год. (стадія 17 пар сомітів) при 21,5(С збільшується втричі, а вміст мітохондріальних білків залишається незмінним. Отже, концентрація мітохондрій в клітинах зародків в’юна на вказаних стадіях зменшується втричі. Звідси випливає, що концентрація мітохондріальних білків не лише не зростає під час зародкового розвитку риб, але й значно зменшується. Дещо інша ситуація складається у ссавців. Морфометрія зародків миші показала, що починаючи із двоклітинної стадії розвитку кількість мітохондрій в зародку безперервно збільшується. В ембріонах щурів з 10-го по 14-й день розвитку, коли відбуваються основні органогенези, зростає. активність таких мітохондріальних ферментів, як цитохромоксидаза та сукцинатдегідрогеназа (Piko, Chase, 1973, Mackler et al., 1971; цит. за: Зотін, Зотіна, 1993(. Під час росту та диференціювання з’являються нові фактори регуляції метаболізму, зокрема нервові та ендокринні. Крім цього, для представників різних класів тварин характерні свої способи регуляції. У зв’язку з цим дані щодо зміни активності мітохондріальних ферментів сильно різняться. Під час розвитку печінки курчати спостерігається зростання активності малатдегідрогенази та цитохромоксидази. Активність цитохромоксидази, сукцинатдегідрогенази, сукцинатцитохром С-редуктази і НАД(Н-цитохром С-редуктази, чутливої до антиміцину А в мітохондріях печінки щура, у багато разів зростає протягом 1 місяця після народження. В процесі розвитку печінки щура відбувається збільшення вмісту цитохромів С1, С, В, аа3. Більш розрізнені результати були одержані Кістлером та Вебером (Kistler, Weber, 1974; цит. за: Озернюк, 1978( при вивченні розвитку печінки шпорцевої жаби в період, що передує метаморфозу, і на його ранніх стадіях. Було показано, що вміст цитохромів аа3, активність сукцинатдегідрогенази, 3-оксіацил-КоА-дегідрогенази, гліцерофосфатдегідрогенази практично не змінюється, тоді як активність глутаматдегідрогенази, глутаматпіруваттрансамінази, 3-оксібутиратдегідрогенази за цей період збільшується. Під час розвитку печінки курчати з 10-го по 20-й день інкубації відбувається деяке збільшення активності цитохромоксидази та сукцинатдегідрогенази. Аналогічні дані були отримані для серця щура, що розвивається, при вимірюванні активності сукцинатдегідрогенази, цитохромоксидази, АТФази і НАД(Н-оксидази. Вміст цитохромів С1, С, В, аа3 під час розвитку печінки також збільшується. Бюхер із співробітниками на підставі результатів, отриманих при вивченні розвитку літального м’язу сарани, зробив висновок про те, що ріст внутрішньої мембрани мітохондрій і збільшення активності (та кількості) її функціональних елементів відбувається синхронно. Другий важливий висновок Бюхера - активність більшості ферментів під час росту мітохондрій змінюється координовано. Висновки, отримані для росту мітохондрій м’язів сарани були підтверджені у вже цитованій роботі Кістлера та Вебера. Ці автори, вивчаючи активність мітохондріальних ферментів під час росту печінки шпорцевої жаби, показали сталість активності більшості вивчених ферментів матриксу і мембран мітохондрій, якщо їх активності перераховувати на вміст цитохромів аа3. (Озернюк, 1978( Крім цих прикладів координована зміна активності ферментів під час розвитку було показано для інших метаболічних систем, зокрема для ферментів гліколізу, гексозомонофосфатного шунта і глюконеогенезу під час оогенезу і раннього зародкового розвитку в’юна (Юровицкий, Мильман, 1971(. На підставі отриманих даних щодо синтезу компонентів дихального ланцюга мітохондрій можна побудувати схему регуляції синтезу конститутивних білків, що належать до певних метаболічних стадій. В основу цієї схеми лягло припущення, що конститутивні білки синтезуються постійно, але зі змінною швидкістю, і тому не потрібно традиційного механізму репресії та депресії генів. Регуляція синтезу білків в даному випадку, на відміну від регуляції синтезу специфічних білків, носить кількісний характер. Друге припущення полягає в тому, що інтенсивність синтезу даного білка визначається його кількістю; останній, в свою чергу, контролюється швидкістю деградації: швидкість швидкість пул синтезованих міто- мітохон- деградація мітох. транскрипції трансляції хондріальних білків дрія білків Таким чином, причиною синхронності синтезу даної групи білків є однакова швидкість їх деградації і координована кількість цих білків у клітині. В основі цього процесу лежить принцип регуляції по типу оберненого зв(язку. Очевидно, синтез білків певними досить великими групами значно спрощує процес регуляції (Зотін, Зотіна, 1993(. Висновки: 1.Біогенез мітохондрії відбувається за участю двох генетичних апаратів - ядерного та мітохондріального. Останній відповідає за синтез невеликої кількості білків, що є компонентами внутрішньої мембрани мітохондрії. 2.Мітохондріальний ДНК-код відрізняється від універсального; тРНК цієї органели здатні зчитувати по 4 кодони, тому для трансляції тут необхідна менша кількість тРНК. 3.Білки мітохондрій, синтезовані у цитоплазмі, транспортуються у мітохондрію за допомогою трьох механізмів, що різняться між собою в залежності від місця їх вбудовування у мембрану органели. 4.В оогенезі хребетних відбуваються значні зміни у структурі та кількості мітохондрій, що відображається на активності поглинання кисню ооцитом. 5.У ембріональному розвитку більшості тварин кількість мітохондрій практично не зростає, тому їх концентрація зменшується. У ссавців спостерігається деяке зростання кількості мітохондрій в ембріогенезі. 6.Регуляція активності мітохондріальних ферментів в ембріогенезі складна і багатоступенева, тому характер зміни цієї активності має дещо неоднозначний характер. Література 1.Айзенштадт Т.В. Цитология оогенеза - М., Наука, 1993, 364с. 2.Билл Дж., Ноулз Дж. Внеядерная наследственность. М., Мир, 1981, 168с. 3.Бурнашева С.А., Габаева Н.С. и др. Современные проблемы сперматогенеза. М., Наука, 1982, 259с. 4.Гаузе Г.Г. Митохондриальная ДНК. М., Наука, 1977, 286с. 5.Данилова Л.В. Ультраструктурные исследования сперматогенеза. М., Наука, 1978, 206с. 6.Зотин А.И., Зотина Р.С. Феноменологическая теория развития, роста и старения организма. М., Наука, 1993, 364с. 7.Кауфман З.С. Эмбриология рыб. М., Агропромиздат, 1990, 272с. 8.Минченко А.Г., Дударева Н.А. Митохондриальный геном. Новосибирск, Наука, 1990, 194с. 9.Озернюк Н.Д. Рост и воспроизведение митохондрий. М., Наука, 1978, 264с. 10.Озернюк Н.Д. Энергетический обмен в раннем эмбриогенезе рыб. М., Наука, !985, 196с. 11.Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. М., Мир, 1975, 424с. Джерела 1.Пинус Е.А., Рабинович Я.М. Некоторые особенности синтеза белка в митохондриях / Молекулярная генетика митохондрий. Л., Наука, 1977, 220с. 2.Шугалий Н.Д. и др. Об особенностях структурной организации генома миттохондрий высших животных / Генетические функции органоидов цитоплазмы. Тезисы докладов симпозиума. Ленинград, 27 -29 ноября 1974г. Л.,!974, 107с. 3.Абрамова Н.Б., Васильева М.Н. Некоторые свойства эмбриональных митохондрий вьюна 4.Данилова Л.В. Ультраструктура жгутиков сперматозоидов // Успехи современной биологии - 1973.-Т.76.- №2(5).-С.246-264. 5.Емельянова Н.Г., Макеева А.П. Ультраструктура сперматозоидов некоторых карповых рыб // Вопросы ихтиологии - 1985.-Т.25.-№3.-С.459-468. 6.Минченко А.Г. Биогенез митохондрий // Успехи современной биологии - 1987.-Т.103.-№3.-С.427-443. 7.Пальмбах Л.Р., Озернюк Н.Д. Рост и воспроизведение митохондрий в ооцитах вьюна // Онтогенез - 1975.-Т.6.-№5.-С.442-449. 8.Юровицкий Ю.Г., Мильман Л.С. Координированное изменение активности ферментов гликолитической цепи в оогенезе вьюна // Биохимия - !971.-Т.36.-С.1130-1143. 9.Anderson S, Bankier A.T. et. al. // Nature - 1981.-V.290.-P.457-469. 10.Chase J.W., Dawid I.B. 1972. Biogenesis of mitochondria during Xenopus laevis development //Development Biology - 1972.-V.27.-№4.-P.504-518.
