Однією із задач спектрофотометричного метода є кількісне визначення величин, які характеризують поглинання даною речовиною монохроматичного випромінювання різних довжин хвиль. Ці величини можуть використані як для кількісної характеристики речовини, так і для кількісного визначення в розчині чи в суміші з іншими речовинами. В зв’язку з поділом електромагнітного спектра по довжині хвилі на певні області можна говорити про спектрофотометрію в інфрачервоній, видимій і ультрафіолетовій області. В ультрафіолетовій і видимій області проявляються електронні спектри молекул, в інфрачервоній області – коливальні спектри.
В сучасних хімічних дослідженнях широко застосовують спектральні методи. Ці методи все більше застосовують в технічному аналізі хіміко-фармацевтичних препаратів, в аптечній практиці. Серед оптичних методів найбільш доступною, а тому і самою поширеною є видима і ультрафіолетова (УФ) спектрофотометрія, яка дозволяє відносно нескладному обладнанні швидко і точно проводити кількісний аналіз речовин.
Спектрофотометрія у видимій області і УФ-областях дозволяє оцінювати ступінь чистоти речовини, ідентифікувати по спектру різні сполуки, визначити константи дисоціації кислот і основ, досліджувати процеси комплексоноутворення.
Інфрачервоні (ІЧ) спектри дають характеристику речовин. Наявність в ІЧ-спектрах тих чи інших полос поглинання дозволяє розшифровувати структуру речовини.
УФ-спектрофотометричне вимірювання проводять в розчинах. Як розчинники використовують очищену воду, кислоти, луги, спирти (метанол, етанол), деякі інші органічні розчинники. Розчинник не повинен поглинати в тій чи іншій області спектра, що і аналізуємо речовина. Характер спектра (структура і положення полос поглинання) може змінюватися в різних розчинниках, а також при зміні рН середовища.
Методом УФ-спектрофотометрії використовують для визначення ідентичності, чистоти і кількісного вмісту лікарських препаратів.
Вивчення спектрів поглинання хімічних речовин з різною структурою дало можливість установити, що основними факторами, які обумовлюють поглинання світла, є наявність так званих хромофорів, т.б. ненасиченість (подвійні чи потрійні зв’язки), наявність карбонільної, карбоксильної, амідної, азо-, нітрозо-, нітро- та інших функціональних груп. Кожна функціональна група характеризується поглинанням в певній області спектра. Але є ряд факторів (присутність декількох хромофорних груп, вплив розчинника та ін.) приводять до зміщення смуг поглинання в сторону більших довжин хвиль (батохромне зміщення) або в сторону коротких довжин хвиль (гіпсохромне зміщення). Крім зміщення може спостерігатися ефект збільшення (гіперхромний) чи зменшення (гіпохромний) інтенсивності поглинання.
В зв’язку з цим для ідентифікації речовин по її УФ0спектру застосовують метод порівняння із спектром відомої речовини, одержаний в тих же умовах. Характеристикою спектра поглинання речовини є положення максимумів (мінімумів) поглинання, а також інтенсивність поглинання, що характеризується величиною густини чи питомого показника поглинання при даній довжині хвилі.
Інфрачервоні (коливальні) спектри використовуються для ідентифікації лікарських препаратів ІЧ-спектри більшості органічних сполук на відміну від УФ-спектрів характеризуються наявністю великою кількістю ліків поглинання. Метод ІЧ-спектроскопії дає можливість одержати найбільш повну інформацію про будову і склад аналізуємої речовини, яка дозволяє ідентифікувати дуже близькі по структурі сполуки. Метод інфрачервоної спектроскопії прийнятий для ідентифікації органічних лікарських речовин з полі функціональними групами шляхом порівняння із спектрами стандартних зразків, які зняті в однакових умовах.
У зв’язку з підвищеними вимогами до якості лікарських речовин ІЧ-спектроскопія, як один із найбільш надійних методів ідентифікації, мають все більше значення. Спектрофотометричне визначення проводять спектрофотометром як забарвлених, так і безбарвних сполук по вибірковому поглинання світла у видимій, ультрафіолетовій чи інфрачервоній областях спектра.
Спектрофотометричний метод аналіза ґрунтується на загальному принципі – пропорціональній залежності між світло поглинанням речовини, її концентрації і товщини поглинаючого шару. Для визначення концентрації розчинів спектрофотометричним методом використовують закон Бугра-Ламберта-Беєра:
EMBED Equation.3 (1)
де С –концентрація досліджуваної речовини у відсотках;
в – товщина шара речовини в сантиметрах;
х – показник поглинання розчину, концентрація якого дорівнює одиниці;
Д – оптична густина.
Визначення оптичної густини проводять на фотоелектричних спектрофотометрах.
Показник поглинання х визначають на основі визначення оптичної густини Д для розчинів з відомою концентрацією по формулі:
EMBED Equation.3 (2)
При цьому, якщо концентрація С виражена в молях на 1 л, то величина х називається молярним показником поглинення а позначається символом EMBED Equation.3 ; якщо концентрація виражена в грамах на 100 мл розчину, то ця величина називається питомим показником поглинання і позначається символом EMBED Equation.3 .
Таким чином, молярний показник поглинання EMBED Equation.3 представляє собою оптичну густину одномолярного розчину речовини при товщині шару 2см; питомий показник поглинання EMBED Equation.3 - оптичну густину розчину, що містить 1г речовини в 100 мл розчину при тій же товщині шару.
Якщо відоме значення х (у формі EMBED Equation.3 , чи EMBED Equation.3 ) визначають концентрацію досліджуваних розчинів по величині оптичної густини Д, користуючись формулою (1). Спектрофотометричне визначення проводиться з використанням еталонів (стандартних розчинів). Питомий показник поглинання вичисляють на основі визначень величини оптичної густини розчину по формулі:
EMBED Equation.3 (3)
Вимірювання оптичної густини розчину необхідно проводити при довжині хвилі Хмах, яка відповідає максимальному поглинанню світла досліджуваним розчином. При цьому досягається найбільша чутливість і точність визначення (Хмах знаходиться експериментально). Значення Хмах вказується в методиках.
Для визначення питомого показника поглинання готують ряд стандартних розчинів з відомою концентрацією досліджуваної речовини в даному розчиннику і для кожного вимірюють оптичну густину, потім розраховуються значення питомого показника поглинання. Знаючи величину питомого показника поглинання і на основі визначеної оптичної густини розчину аналізуємої речовини невідомої концентрації, можна розрахувати її вміст по формулі:
EMBED Equation.3 (4)
При виборі розчинника важливо, щоб він не поглинав в тій же області спектра, що і розчинена речовина.
Спектрофотометрія – визначення кількості речовини в забарвленому або в незабарвленому розчині по вимірюванні світопоглинання хвиль певної довжини. Світопоглинання вимірюють з допомогою фотоелемента по зміні сили фото потоку, який виникає в ньому, при падінні на фотоелемент світлового потоку, який пройшов через контрольний, а потім досліджуваний розчин. Вимірювання світопоглинання проводять в приладі спектрофотометрі, кварцева призма якого виявляє монохроматичні пучки спектра, які відповідають забарвленню розчину досліджуваної речовини.
Прилад має 3 джерела світла; лампа накалювання, водородною і ртутної лампою. Світло від джерела (1) падає на дзеркальній конденсор (2), який збирає його і направляє на плоске дзеркало (3). Дзеркало відхиляє пучок променів на 900 і направляє його через лінзу (4) у вхідну щілину (5), через яку світло проникає на дзеркальний об’єктив (6).я кий являє собою сферичне дзеркало.
Від дзеркального об’єктива паралельний пучок променів попадає на кварцеву призму (7), яка розкладає його в спектр (диспергує). Диспергований пучок направляється знову на об’єктив і фокусується ним на вихідній щілині (8), яка розміщена під вхідною щілиною. Обертаючи кварцеву призму, можна одержувати на виході світла різних довжин хвиль. Довжина хвилі залежить від кута повороту призми.
Монохроматичні промені, пройшовши щілину (8), кварцеву лінзу (9) і світлофільтр, який поглинає розсіяне світло (10), попадають в кювету з контрольним чи досліджуваним розчином (11). Тут частина світла поглинається, а промені, які пройшли через розчин попадають на фотоелемент (12).
Методика визначення спектрофотометрії.
Включення приладу у сітку проводиться згідно інструкцію.
Після включення освітлювача (Л) лампи накалювання чи водневої лампи, які встановлюються переключателем, який знаходиться на задній частині кожуха, і підсилювача в електричну сітку слідує:
встановити в кюветодержачі кювети з контрольним і досліджуваним розчином, помістити кюветодержач в кюветний відділ (1) таким чином, щоб на шляху потоку випромінювання знаходився контрольний розчин (кюветодержач повинен бути повернутий білою точкою до працюючого), закріпити його пружинячи зажимом, закрити кришку кюветного відділу.
Поворотом року ятки шкали довжини хвиль (4) установити на шкалі (13) значення необхідної довжини хвилі;
Рукояткою (15) установити в робоче положення фотоелемент;
Поставити переключатель (2) в положення „викл.” І закрити фотоелемент, поставити шторку (3) в положення „закр.”;
Рукоятку (5) держача світофільтрів установити на вказівник відповідного світофільтра;
Поставити рукоятку (6) в одне із положень – 1, 2, 3 чи 4. Потрібно мати на увазі, що якщо потрібно вимірювати з великою чутливістю і можна знехтувати зниженням монохроматичності і працювати з широкою цілиною, то необхідно поставити рукоятку (6) в положення 1; якщо, навпаки, необхідно працювати з вузькою щілиною, то проводяться вимірювання при положенні 4.
Скомпенсувати темновий потік рукояткою грубо (7) і плавно (8) регулювання, підводячи стрілку міліамперметра (14) до нуля;
Відкрити фотоелемент, поставити рукоятку (3) в положення „відкр.”;
Змінюючи ширину щілини обертання рукоятки (9), установити стрілку міліамперметра на нульове значення, більш плавно це може бути зроблено поворотом рукоятки потенціометра чутливості (10);
Установити на шляху випромінювання досліджуваний зразок, переміщаючи каретку з кюветодержачем рукояткою (11);
Поставити переключатель (2) в положення І поворотом рукоятки (12) відлікового потенціометра, відновити нульове положення стрілки міліамперметра. По шкалі (16) цього потенціометра зняти відлік оптичної густини (верхня шкала) або проценту пропускання (нижня шкала). Відлік потрібно зробити 3-4 рази; значення береться середній результат.
